【摘要】目的   探讨 ALT 持续正常的 HBeAg 阴性慢性 HBV 感染者病毒学因素与肝脏组织学改变的关系。 方法   检测 52 例研究对象的 HBV DNA 水平、基因型、基本核心启动子（ BCP ）与前 C 区变异，分析各病毒学因素对肝脏组织学改变的影响。正态分布数据两组间均数比较采用 t 检验，多组均数比较采用单因素方差分析；非正态分布数据比较采用 Mann-Whitney U 检验；两样本率的比较用χ 2 检验及 Fisher 精确概率法； HBV DNA 与肝脏组织学的关系等非参数双变量相关分析采用 Spearman 相关系数方法；采用受试者工作特征曲线下面积评价 HBV DNA 水平对肝脏病理改变的诊断价值。 结果   BCP 与前 C 区联合突变组的病毒载量高于非联合突变组［（ 4.9 ± 1.4 ） log10 拷贝 /ml 比（ 4.1 ± 1.1 ） log10 拷贝 /ml ， t ＝ 2.308 ， P ＜ 0.05 ］；联合突变组 32.1% 的患者 HAI ≥ 4 分、 14.3% 的患者 F ≥ 3 分。前 C 区或 BCP 野毒株的感染者中， HBV DNA 与肝脏炎症呈正相关（ r 值分别为 0.626 和 0.592 ， P 值均＜ 0.01 ）、与纤维化改变也呈正相关（ r 值分别为 0.730 和 0.641 ， P 值均＜ 0.01 ）。在无联合突变的研究对象中， HBV DNA 用于预测其 F ≥ 3 分的肝脏病理改变有显著意义（受试者工作特征曲线下面积为 0.905 ， 95% 可信区间为 0.771 ～ 1.039 ， P ＜ 0.05 ），临界值为 4.5log10 拷贝 /ml （敏感度 1.000 ，特异度 0.778 ，阳性预测值为 42.9% ，阴性预测值为 100.0% ）。基因 B 型的 HBV DNA 高于 C 型［（ 5.1 ± 1.5 ） log10 拷贝 /ml 比（ 4.3 ± 1.0 ） log10 拷贝 /ml ］，差异有统计学意义（ t ＝ 2.059 ， P ＜ 0.05 ）；但两者在显著肝脏病理改变方面的差异无统计学意义。 结论   HBV 联合突变株的复制能力最强，并且部分联合突变株感染者出现显著肝组织学改变，此类患者有必要接受抗病毒治疗。在前 C 区或 BCP 变异野毒株感染者中， HBV DNA 与肝脏的炎症、纤维化改变呈正相关；病毒载量用于预测这部分感染者 F ≥ 3 分的肝脏病理改变有显著意义。

【关键词】肝炎病毒，乙型； 丙氨酸转氨酶； 基本核心启动子； 前 C 区； 肝组织学

Viral factors influencing histological changes of HBeAg-negative chronic hepatitis B patients with persistently normal serum ALT levels      YANG Yan-hua, XIE Qing, WANG Hui, ZHOU Hui-juan, GUI Hong-lian, CAI Wei, GUO Si-min, YU Hong, GUO Qing.   Department of Infectious Diseases, Ruijing Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China

Corresponding author: XIE Qing, Email: xieqingrj@ yahoo.com.cn

【 Abstract 】 Objective     To investigate the correlation between viral factors and liver histological changes of HBeAg-negative chronic hepatitis B patients with persistently normal serum ALT levels (PNAL).   Methods     HBV DNA level, HBV genotype, basal core promoter (BCP)   and precore mutation were examined in 52 HBeAg-negative chronic hepatitis B patients with PNAL (defined as normal ALT measured on at least 3 occasions in the intervals of about two months over a period of 12 months or more prior to the biopsy).   Results     Subjects with both BCP and precore mutations had significantly higher HBV DNA levels than those without mutations [(4.9 ± 1.4) vs (4.1 ± 1.1) log10copies/ml, t = 2.308, P < 0.05]. A higher proportion of patients with histological activity index (HAI) ≥ 4 was found in patients with both mutations (32.1% vs 16.7%) than in patients without mutation, however, the proportion of patients with histological activity index   (HAI) ≥ 3 in patients with mutations was not significantly different from that in patients without mutations (14.3% vs. 12.5%, χ 2 = 0.000, P > 0.05). In patients without precore or BCP mutations, there was a strong positive correlation between viral load and liver inflammation as well as fibrosis (precore: r = 0.626, 0.592, P < 0.01; BCP: r = 0.730, 0.641, P < 0.01). In patients without both mutations, HBV DNA has shown a high accuracy for predecting fibrosis (F ≥ 3) (AUC = 0.905, 95% CI: 0.771-1.039, P < 0.05) with the cutoff value of 4.5 log10copies/ml (sensitivity = 1.000, specificity = 0.778, PPV = 42.9%, NPV = 100.0%). Results of both genotypes and mutations were successfully obtained in 40 samples with HBV DNA ≥ 104 copies/ml. The higher viral load was observed in the patients with genotype B than genotype C (5.1 vs 4.3 log10copies/ml, t = 2.059, P < 0.05), but no difference was seen of liver pathologic changes between these two genotypes.   Conclusions     Virus harboring both BCP and precore mutants has the higher replication level than wild type virus. 32.1% and 14.3% of the patients with both mutations have moderate or severe inflammation and fibrosis. There was a strong positive correlation between viral load and liver histological changes in patients without precore or BCP mutations, and viral load shows a high accuracy for predecting significant fibrosis (F ≥ 3).

【 Key words 】 Hepatitis B virus; Alanine transaminase; Basal core promoter;    Precore; Liver histology

肝穿刺活组织检查在慢性乙型肝炎的临床处理中占据重要地位，慢性乙型肝炎防治指南推荐血清 ALT<2 倍正常值上限，但肝活组织检查提示“中度 / 中度以上炎症［肝脏炎症活动指数（ histological activity index ， HAI ）≥ 4 ］或显著纤维化［肝纤维化评分（ F ）≥ 3 ］” [1] 的患者有必要行抗病毒治疗。多项研究表明，病毒学因素与 HBV 感染后肝硬化、肝癌的发生密切相关 [2-3] 。然而目前关于 ALT 持续正常的 HBeAg 阴性慢性 HBV 感染者的研究甚少。本研究旨在探讨 HBV DNA 水平、基因型、基本核心启动子（ basal core promoter ， BCP ） / 前 C 区变异等病毒学因素对这部分感染者肝脏组织学改变的影响。

资料与方法

1 ．研究对象：上海交通大学医学院附属瑞金医院 2005 年 11 月－ 2008 年 3 月行经皮肝穿刺活组织检查的患者 52 例，均签署知情同意书并符合以下入选标准：（ 1 ） HBsAg 阳性持续 6 个月以上；（ 2 ） HBeAg 阴性、抗 -HBe 阳性；（ 3 ）入组前至少 1 年内连续定期随访 3 次以上，血清 ALT 均在正常范围；（ 4 ）排除其他慢性肝损害疾病；（ 5 ）入组前未接受任何抗病毒治疗；（ 6 ） HBV DNA ≥ 103 拷贝 /ml ，并有血清保留。生物化学指标及保留血清均采集自肝活组织检查前后 1 周内，基本信息包括性别、年龄、体重指数（ body mass index ， BMI ）、 HBV 感染的家族史与饮酒史。

2 ．血清保留：用无菌真空普管采集患者全血，室温离心，血清分装至 600 μ l 经蒸汽高压消毒的 EP 管内，于 -70 ℃ 长期保存。

3 ．病理检查： B 超定位后，采用 16 号穿刺针，一秒钟负吸法于呼气末进行肝活组织检查。要求肝组织长度≥ 1cm ，包含≥ 4 个可供评价汇管区。肝组织标本用 4% 甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，苏木素 - 伊红与网状纤维染色。由有经验的病理学专家在未知患者疾病状态的情况下独立完成所有病理诊断。肝脏炎症分级（ 0 ～ 18 ）与纤维化分期（ 0 ～ 6 ）采用 Ishak 评分 [4] 。

4. 实验室检测：血清 ALT 采用自动生化仪 CX5 PRO （购自美国 Beckman 公司）检测，正常上限为 64U/L 。血清 HBV 标志物采用美国 Abbott 试剂盒，用 ARCHITECT i2000 SR 化学发光微粒免疫测定法检测。 HBV DNA 采用深圳匹基公司的试剂盒与 ABI 7500 实时 PCR 定量检测仪，用实时聚合酶链反应法检测；检测低限为 1.0 × 103 拷贝 /ml 。基因型采用杭州博赛公司的试剂盒与 ABI 7500 实时 PCR 定量检测仪，利用核酸扩增、荧光标记探针的方法，对血清中 B 型和 C 型病毒进行检测，所需病毒载量≥ 104 拷贝 /ml 。 BCP 、前 C 区变异检测采用 PCR 方法对 BCP 、前 C 区基因进行扩增，凝胶鉴定 PCR 产物并割胶纯化，经 BDT 反应，上 3700DNA 分析仪行电泳进行序列分析，使用 DNAStar 对样品测序结果进行分析、统计（原理和步骤见试剂盒说明书）。所需病毒载量≥ 1.0 × 103 拷贝 /ml 。

5. 统计学分析：应用 SPSS11.0 软件，年龄、病毒载量、 BMI 、肝组织长度、汇管区数目等正态分布数据用均数±标准差（ x- ± s ）表示，两组均数比较采用 t 检验，多组均数比较采用单因素方差分析。随访年限、肝脏炎症与纤维化分值等非正态分布数据用中位数（范围）表示非参数统计，两组之间比较采用 Mann-Whitney U 检验。两样本率的比较用χ 2 检验及 Fisher 精确概率法。 HBV DNA 与肝脏组织学的关系等非参数双变量相关分析采用 Spearman 相关系数方法。 P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。采用受试者工作特征（ receiver operating characteristic ， ROC ）曲线与计算 ROC 曲线下面积（ area under the curve ， AUC ）评价 HBV DNA 水平对显著肝脏病理改变的诊断价值， AUC 在 0.5 ～ 0.7 表示诊断价值较低，在 0.7 ～ 0.9 表示诊断价值中等，＞ 0.9 表示诊断价值较高。同时计算每个 AUC 的 95% 可信区间（ confidence interval ， CI ），根据此区间是否与 AUC 0.5 交叉近似判断各总体 AUC 是否相等，近似 P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。对于有显著诊断价值的 ROC 曲线，选取其左上角灵敏度与特异度之和最大的数据作为临界值。

结     果

1. 一般情况： 52 例患者中男 36 例，女 16 例，年龄（ 41.0 ± 10.7 ）岁， 11.6% 有饮酒史（饮酒量男性＞ 40g /d ，女性＞ 20g /d ）， 57.7% 有明确的 HBV 感染家族史， BMI 值 23.4 ± 3.44 。患者病毒载量（ 4.5 ± 1.29 ） log10 拷贝 /ml ， ALT （ 33.6 ± 13.61 ） U/L ， ALT 正常年限 1 ～ 27 年，中位数 8 年。肝组织标本平均长度（ 1.50 ± 0.64 ） cm ，可供评价汇管区平均（ 8.0 ± 2.9 ）个。

2 ．肝脏组织学改变：按无炎症（ HAI 0 ）、轻度炎症（ HAI 1 ～ 3 ）、轻中度炎症（ HAI 4 ～ 8 ）、中度炎症（ HAI 9 ～ 12 ）、重度炎症（ HAI 13 ～ 18 ）划分肝脏炎症坏死评分 [5] ：各炎症等级患者分别占 53.8% 、 21.2% 、 19.2% 、 5.8% 、 0 ； F 0 、 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 分的患者分别占 63.5% 、 13.5% 、 9.6% 、 3.8% 、 1.9% 、 3.8% 、 3.8% ；其中 HAI ≥ 4 分和 F ≥ 3 分的患者分别占 25.0% 和 13.5% 。

3. HBV 基因型： 40 例 HBV DNA ≥ 104 拷贝 /ml 的研究对象成功进行 B 、 C 基因型检测，两种基因型感染者各 20 例。 B 型感染者中 HAI ≥ 4 分、 F ≥ 3 分的患者分别占 30% （ 6/20 ）、 15% （ 3/20 ）， C 型感染者中 HAI ≥ 4 分、 F ≥ 3 分的患者分别占 25% （ 5/20 ）、 10% （ 2/20 ）， B 、 C 基因型患者 HAI 和 F 评分差异无统计学意义（χ 2 值分别为 0.125 和 0 ， P 值均＞ 0.05 ）。

4 ． BCP 与前 C 区变异： 52 例样本均成功进行 BCP 、前 C 区变异的检测。突变株（ mutant ）占主导地位（包括纯合或杂合突变与缺失）—— BCP 占 67.3% ，前 C 区占 59.6% ；其中，纯合突变株 A1762T 、 G 1764A 、 G 1896A 在各位点所占比例分别为 50.0% 、 48.1% 、 50.0% ， BCP 还有 2 例位点缺失患者。（ 1 ）不同 BCP 、前 C 区状态下的肝脏炎症改变：将患者分为突变株亚组与野毒株（ wild-type ）亚组，其人口学资料与肝组织标本质量均具有良好的可比性（表 1 ， 2 ）。前 C 区突变株亚组中 HAI ≥ 4 分的患者比例为 29.0% （ 9/31 ），高于野毒株亚组的 19.0% （ 4/21 ），但差异无统计学意义（χ 2 ＝ 0.666 ， P ＞ 0.05 ），见图 1 ； BCP 突变株与野毒株亚组间各炎症等级的构成比较为相似。根据 BCP 和前 C 区突变检测结果，将 52 例患者分为 4 组：第一组 13 例，同时感染 BCP 与前 C 区野毒株；第二组 8 例，感染 BCP 突变株与前 C 区野毒株；第三组 3 例，感染 BCP 野毒株与前 C 区突变株；第四组 28 例，同时感染 BCP 与前 C 区突变株，即联合突变组。分析其炎症等级的构成比发现，仅存在单一 BCP 或前 C 区突变的亚组 HAI 均＜ 4 分，其中第三亚组（ BCP 野毒株 + 前 C 区突变株）的 3 例患者肝脏均无炎症改变；而第一亚组（ BCP 与前 C 区均为野毒株）与第四亚组（ BCP 与前 C 区均为突变株）中 HAI ≥ 4 分的患者比例十分接近（图 2 ）。（ 2 ）不同 BCP 、前 C 区状态下的肝脏纤维化改变： BCP 与前 C 区亚组的纤维化患者构成比见图 3 ，各野毒株亚组无 F ＝ 6 分的患者。将研究对象按上述方法分为 4 个亚组后发现， F ＝ 6 分的 2 例患者均在第四亚组，即均存在 BCP 与前 C 区联合突变；而仅存在单一突变的亚组 F 均＜ 2 分，其中第三亚组（ BCP 野毒株 + 前 C 区突变株）的 3 例研究对象肝脏均无纤维化改变（图 4 ）。（ 3 ） BCP 与前 C 区联合突变的肝脏组织学改变：考虑到各组人数分布的均衡性，将前 3 组予以合并，分为 BCP 与前 C 区联合突变组（ 28 例）与非联合突变组（ 24 例），前者 HAI ≥ 4 分的患者占 32.1% （ 9/28 ），高于后者的 16.7% （ 4/24 ），但差异无统计学意义（χ 2 ＝ 1.651 ， P ＞ 0.05 ）；两组 F ≥ 3 分的患者比例分别为 14.3% （ 4/28 ）和 12.5% （ 3/24 ），差异无统计学意义（χ 2 ＝ 0 ， P ＞ 0.05 ）。

5 ． HBV DNA 水平：（ 1 ） HBV DNA 水平对 HAI ≥ 4 、 F ≥ 3 分的影响： HAI ≥ 4 分的患者 HBV DNA 水平高于 HAI ＜ 4 分的患者［（ 5.2 ± 1.8 ） log10 拷贝 /ml 比（ 4.2 ± 1.0 ） log10 拷贝 /ml ］， F ≥ 3 分的患者 HBV DNA 水平高于 F ＜ 3 分的患者［（ 5.1 ± 1.5 ） log10 拷贝 /ml 比（ 4.4 ± 1.2 ） log10 拷贝 /ml ］，但差异均无统计学意义（ t 值分别为 1.880 和 1.434 ， P 值均＞ 0.05 ）。 ROC 曲线分析显示， HBV DNA 对 HAI ≥ 4 分的患者诊断价值较低（ AUC ： 0.657 ， 95% CI ： 0.483 ～ 0.830 ， P ＞ 0.05 ），见图 5A ；对 F ≥ 3 分的患者诊断价值也较低（ AUC ： 0.651 ， 95% CI ： 0.413 ～ 0.889 ， P ＞ 0.05 ），见图 5B 。（ 2 ） BCP 、前 C 区野毒株感染者中 HBV DNA 与肝脏组织学改变的关系：前 C 区野毒株亚组中， HAI ≥ 4 分的患者 HBV DNA 高于 HAI ＜ 4 分的患者［（ 5.1 ± 1.4 ） log10 拷贝 /ml 比（ 3.9 ± 1.0 ） log10 拷贝 /ml ］， F ≥ 3 分的患者 HBV DNA 高于 F ＜ 3 分的患者［（ 5.7 ± 1.3 ） log10 拷贝 /ml 比（ 3.8 ± 0.9 ） log10 拷贝 /ml ］，差异均有统计学意义（ t 值分别为 2.142 和 3.075 ， P 值均＜ 0.05 ）；相关分析显示， HAI ≥ 4 分及 F ≥ 3 分患者的 HBV DNA 与炎症及纤维化评分均呈显著正相关（ r 值分别为 0.626 和 0.592 ， P 值均＜ 0.01 ）。 BCP 野毒株亚组中， F ≥ 3 分的患者 HBV DNA 高于 F ＜ 3 分者［（ 5.7 ± 1.3 ） log10 拷贝 /ml 比（ 3.9 ± 1.0 ） log10 拷贝 /ml ］，差异有统计学意义（ t ＝ 2.719 ， P ＜ 0.05 ）； HAI ≥ 4 分的患者 HBV DNA 高于 HAI ＜ 4 分者［（ 5.1 ± 1.4 ） log10 拷贝 /ml 比（ 3.9 ± 1.0 ） log10 拷贝 /ml ］，但差异无统计学意义（ t ＝ 1.786 ， P ＞ 0.05 ）；相关分析显示， HAI ≥ 4 分及 F ≥ 3 分患者的 HBV DNA 与炎症及纤维化评分亦呈显著正相关（ r 值分别为 0.730 和 0.641 ， P 值均＜ 0.01 ）。对 24 例 BCP 或前 C 区野毒株感染者的 HBV DNA 水平进行 ROC 曲线分析，结果发现 HBV DNA 对 HAI ≥ 4 分患者的诊断价值中等（ AUC ： 0.812 ， 95% CI ： 0.628 ～ 0.997 ），但差异无统计学意义（ P ＞ 0.05 ），见图 6A ； HBV DNA 用于预测 F ≥ 3 分患者的肝脏病变有显著意义（ AUC ： 0.905 ， 95% CI ： 0.771 ～ 1.039 ， P ＜ 0.05 ），见图 6B 。选取图 6B 左上角灵敏度与特异度之和最大的数据 4.5log10 拷贝 /ml 为临界值，则诊断的敏感度＝ 1.000 ，特异度＝ 0.778 ，阳性预测值＝ 42.9% ，阴性预测值＝ 100.0% 。

6 ． HBV 基因型、 BCP/ 前 C 区突变及 HBV DNA 水平之间的关系： B 基因型病毒的平均 HBV DNA 水平高于 C 型［（ 5.1 ± 1.5 ） log10 拷贝 /ml 比 (4.3 ± 1.0) log10 拷贝 /ml ］，差异有统计学意义（ t ＝ 2.059 ， P ＜ 0.05 ）。 B 基因型患者发生前 C 区突变的比例高于 C 基因型患者（ 15/20 比 10/20 ），但差异无统计学意义（χ 2 ＝ 2.667 ， P ＞ 0.05 ）；两组 BCP 突变差异无统计学意义（ 15/20 比 14/20 ，χ 2 ＝ 0.125 ， P ＞ 0.05 ）。与野毒株相比， BCP 及前 C 区突变株的病毒载量较高［（ 4.6 ± 1.3 ） log10 拷贝 /ml 比（ 4.2 ± 1.2 ） log10 拷贝 /ml ，（ 4.8 ± 1.3 ） log10 拷贝 /ml 比（ 4.1 ± 1.1 ） log10 拷贝 /ml ］，但差异无统计学意义（ P 值均＞ 0.05 ）。根据变异检测结果，按前述方法将 52 例患者分为 4 组，联合突变组 HBV DNA 水平最高［（ 4.9 ± 1.4 ） log10 拷贝 /ml ］，见图 7 ；两两比较结果显示，第二组与第四组的 HBV DNA 水平差异有统计学意义［（ 3.7 ± 1.7 ） log10 拷贝 /ml 比（ 4.9 ± 1.4 ） log10 拷贝 /ml ， P ＜ 0.05 ］。将前三组予以合并，联合突变组的病毒载量高于非联合突变组［（ 4.9 ± 1.4 ） log10 拷贝 /ml 比（ 4.1 ± 1.1 ） log10 拷贝 /ml ］，差异有统计学意义（ t ＝ 2.308 ， P ＜ 0.05 ）。

讨     论

体外研究结果表明， BCP 突变通过病毒前基因组二级结构的碱基替换、减少与肝脏特异转录因子的结合，使前基因组 RNA 转录增加，促进 HBV 的复制，并在转录水平影响 HBeAg 表达 [6-7] 。前 C 区 1896 位点单个碱基的替换造成翻译终止密码的产生（密码子 28 由 TGG 变为 TAG ； TAG 为终止密码子），阻止前 C 区蛋白的翻译，阻遏 HBeAg 的合成 [8] 。

本研究结果显示，发生 BCP 或前 C 区突变的患者具有较高的病毒载量；且联合突变者的病毒载量高于非联合突变组，其 HBV DNA 水平与“ BCP 突变株 + 前 C 区野毒株”亚组相比也存在统计学差异，这提示联合突变株的复制能力最强，而前 C 区突变可能对已存在 BCP 突变的病毒复制起着促进作用。

本研究中，基因 B 型 HBV 的平均 HBV DNA 水平略高于 C 型，这可能与前者更容易发生前 C 区变异有关。因为密码子 28 是前 C 区基因内的ε结构中的倒数第二个密码子，而ε结构是一个高度保守的茎襻结构，其中的 nt1896 和茎襻结构中的 nt1858 位形成碱基配对 [9] 。在 B/D/E/G 型 HBV 的前 C 区茎襻结构中，第 1858 位碱基是一个胸腺嘧啶，发生 G1896A 变异后，第 1858 和 1896 碱基形成 T-A 配对，有利于稳定ε结构，因此，这些基因型的 HBV 容易发生前 C 区变异 [10-12] 。

HBV 病毒学因素之间错综复杂的关联，导致其对 HBV 感染后的肝脏病理改变产生各种不同的影响。一项关于 HBeAg 阴性的血清 ALT 水平持续正常携带者的研究显示， ALT 水平正常高值者与正常低值者相比， BCP 突变的发生率更高，该发生率随年龄的增长而增加 [13] 。但该研究未获得肝脏组织学资料，仅对病毒变异与肝脏炎症的关系作了间接讨论。本研究通过病毒学、组织学资料分析，结果显示 32.1% 联合突变组患者 HAI ≥ 4 分；在纤维化改变方面，各野毒株亚组均无 F ＝ 6 分的患者，仅有的 2 例 F ＝ 6 分患者为存在 BCP 与前 C 区联合突变者。以上结果提示，部分联合突变者存在显著的肝脏病理改变，有必要对这些患者进行抗病毒治疗以阻止疾病进展。虽然未能找到一个理想的 HBV DNA 界值来判断是否发生显著肝脏病理改变，但本研究去除了联合突变这一因素的干扰之后，通过 ROC 曲线分析，发现在无联合突变的研究对象中， HBV DNA 用于诊断其 F ≥ 3 分的肝脏组织学改变有显著意义，临界值为 4.5log10 拷贝 /ml （阳性预测值 42.9% ，阴性预测值 100.0% ）。我们也发现，前 C 区与 BCP 均为野毒株的患者，其病毒载量及发生肝脏病理改变的比例均高于前 C 区或 BCP 单独突变的患者。鉴于本研究病例数有限，我们将在扩大样本量后继续对其中的规律加以探讨。

参   考   文   献

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