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3-磷酸甘油酸脱氢酶及其抗体对自身免疫性肝炎的诊断意义
http://www.ganbingzixun.com     点击数:1156     更新时间:2009-11-30    【查看评论

【摘要】目的   克隆 D-3- 磷酸甘油酸脱氢酶( Phgdh )的 cDNA ,构建重组表达质粒,纯化重组蛋白,初步探讨 Phgdh 抗体在自身免疫性肝炎诊断中的意义。 方法   血清蛋白质组学方法鉴定差异蛋白,构建重组表达载体,在大肠杆菌中表达,融合蛋白经 Ni-NTA 树脂柱亲和层析纯化,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳及 Western blot 法进行免疫鉴定;应用表达蛋白建立间接酶联免疫吸附法,检测 60 名健康体检者、 65 例自身免疫性肝炎( AIH )、 122 例原发性胆汁性肝硬化、 56 例慢性乙型肝炎、 117 例慢性丙型肝炎患者血清中抗 Phgdh 抗体。组间率的比较用χ 2 检验。 结果   经重组质粒测序和酶切鉴定结果证实, Phgdh 目的基因已正确插入原核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达产物在相对分子质量约 6.0 × 104 附近有一明显的蛋白表达带, Western blot 分析结果显示重组蛋白具有 Phgdh 抗原反应性。酶联免疫吸附法检测血清标本结果显示, AIH 、原发性胆汁性肝硬化、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎及正常人抗 Phgdh 抗体阳性检出率分别为 66.15% 21.42% 12.50% 6.83% 3.30% AIH Phgdh 自身抗体阳性率与疾病对照组及正常对照组比较,差异均具有统计学意义( P<0.01 )。 结论   本研究成功克隆了 Phgdh cDNA ,并将其在大肠杆菌中成功表达。该抗体主要在 AIH 患者中检出,此抗体的检测有助于提高 AIH 的临床诊断水平。

【关键词】肝炎,自身免疫性; D-3- 磷酸甘油酸脱氢酶; 蛋白质组; 自身抗体; 自身抗原

 

Cloning and expression of 3-phosphoglycerate dehydrogenase gene and its correlative antibodies in diagnosis of autoimmune hepatitis    XIANG Dai-jun*, YAN Hui-ping, XIA Qing, LU Feng, FENG Xia, ZHAO Yan, LIU Yan, YANG Jian-xuan. * Research Center for Infection and Immunity of   Beijing You’an Hospital, Capital Medical University, Beijing 100069, China

Corresponding author:YAN Hui-ping, Email: yhp503@ vip.sina.com

Abstract Objective     To evaluate whether the D-3-phosphoglycerate dehydrogenase (Phgdh) correlative antibodies is crucial for AIH, we cloned Phgdh cDNA and constructed plasmid, then purified and identified the immunoreactivity of the recombinant protein, and established the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) to detect Phgdh autoantigen correlative antibodies in diagnosis of autoimmune hepatitis. Methods     The constructed plasmid was transformed into E. coli. BL21(D3). This fusion protein was purified by Ni-NTA chromatography and its immunoreactivity was identified by SDS-PAGE and Western blot. The ELISA with the fusion protein was established first, then, the Phgdh autoantigen correlative antibodies in serum of patients with AIH (65) and patients with PBC (122) as well as chronic hepatitis B (CHB) (56), chronic hepatitis C (CHC) (117), and normal controls (60) were detected. Results     The sequence of Phgdh autoantigen gene was the same as the sequence reported on the genebank. The fusion protein was found about 60kD strip on SDS-PAGE. Western blot analysis showed that the fusion protein had immunoreactivity. When analyzing the serum by ELISA, the immune reactivity to Phgdh was detected in 66.15% of patients with AIH, 21.42% of patients with PBC, 12.50% of patients with CHB, 6.83% of patients with CHC, and 3.30% of normal individuals. The differences of prevalence between AIH patients and healthy controls as well as other diseases were of statistical significance (P < 0.01). Conclusion     The Phgdh cDNA is successfully cloned into E. coli BL21 (D3). The frequency of antibodies to Phgdh is much higher in patients with AIH than in patients with PBC, CHB, CHC and normal control. The antibodies to Phgdh may have utility in improved diagnosis of AIH.

Key words Hepatitis, autoimmune;   D-3-phosphoglycerate dehydrogenase;   Proteomics;   Autoantibody;   Autoantigen

自身免疫性肝炎( autoimmune hepatitis, AIH )是一种原因不明的肝脏疾病,具有一般肝病临床特征,伴有高丙种球蛋白血症、自身抗体阳性,病理特征表现为肝脏界面性炎症及淋巴细胞浸润,多见于女性,男女发病比例中女性占 60% ,本病对激素治疗有效,不及时治疗其预后不良,因此 , 早期准确诊断 AIH 极为重要。目前对 AIH 的诊断主要是通过临床资料、生物化学、免疫学等实验室检查及病理学结果的综合分析才能作出诊断。国际自身免疫性肝炎研究组 1992 年制定了诊断标准,自身抗体的检测是 AIH 诊断及分型的主要实验室指标 [1-2] AIH 相关的自身抗体包括抗核抗体、抗平滑肌抗体等,但这些自身抗体对 AIH 并不是疾病特异的,其他肝炎或自身免疫性疾病中也可检出相同的自身抗体 [3] 。现行检测的自身抗体谱中其相应抗原的本质也并不清楚, AIH 患者新的自身抗原的筛选与鉴定是国内外的研究热点之一。

近年来,我们利用免疫蛋白质组学策略,对 AIH 和正常人血清进行研究,经二维电泳、 MALDI-TOF-MS 质谱分析等方法鉴定出 D-3- 磷酸甘油酸脱氢酶( D-3-phosphor-glycerate dehydrogenase, Phgdh )有可能是 AIH 相关的新的自身抗原 [4-5] 。本研究利用基因工程技术在大肠杆菌中克隆表达 Phgdh 重组蛋白,分析其相应抗体在 AIH 和其他肝病中的检出率,初步评价其抗体在 AIH 临床诊断中的价值。

资料与方法

1. 研究对象:北京佑安医院 2002-2007 年患者的标本, AIH 患者 65 例,男 22 例,女 43 例,平均年龄 53.2 岁( 14 83 岁)。 AIH 的诊断参照 1999 年国际自身免疫性肝炎研究组制定的标准。原发性胆汁性肝硬化( PBC )患者 122 例(按美国肝病学会 2000 年推荐的 PBC 诊断指南诊断)。病毒性肝炎患者组 173 例,其中,慢性乙型肝炎( CHB 56 例,慢性丙型肝炎( CHC 117 例(病毒性肝炎按 2005 年《慢性乙型肝炎防治指南》诊断)。正常献血员血清标本 60 份(来自北京红十字血液中心)。

2 .质粒和菌株: pMD19-T 载体购自大连宝生物生物技术有限公司, E.coli DH5 α和 BL-21 DE3 )购自北京天根生物有限公司, pET22b(+) 质粒由军事医学科学院夏晴博士提供。

3 .试剂和仪器:各种限制性内切酶、 T4 DNA 连接酶、 Taq 酶、 DNA 相对分子质量标准品、低分子量蛋白质标准品, 3S Trizol RNA 抽提试剂盒、反转录试剂盒、质粒抽提和胶回收试剂盒购自大连宝生物生物技术有限公司);引物由上海生工生物工程公司合成;核糖核酸酶 RNase A 、氨苄西林、降偏氟乙烯膜购自北京普利莱基因技术公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG 和羊抗人 IgG 购自北京中杉金桥生物有限公司;鼠抗人 3- 磷酸甘油酸脱氢酶单克隆抗体购自美国 GeneTex 公司; Ni+-NTA 树脂亲和层析柱购自美国 Invitrogen 公司; PCR 扩增仪购自美国 Thermo 公司;凝胶成像系统和蛋白电转移装置美国 Bio-Rad 公司。

4 HepG2 细胞总 RNA 提取和扩增:收获培养 HepG2 细胞,用 RNA 提取试剂盒提取总 RNA ,以其逆转录产物 cDNA 为模板,根据基因库中人 Phgdh 基因参考序列( NM006623.2 ),设计合成 PCR 扩增引物。上游引物( Nde Ⅰ): 5 -GGAAT TCCATATGGCTTTTGCAAATCTGCGGAAAG TGCTCA-3 ′;下游引物( Xho Ⅰ): 5 -CCGCTCG AGGAAGTGGAACTGGAAGGCTTCAGTCAC ATGCT-3 ′; PCR 条件: 95 5min 95 50s 60 50s 72 90s 30 个循环; 72 5min 。取 10 μ l 进行 10g /L 琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。

5 .重组表达质粒的构建及转化:参照《分子克隆实验指南(第 3 版)》的方法,对纯化回收的 PCR 产物进行 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切,并与同样双酶切的表达载体进行连接,构建重组质粒 pET-22b(+)-Phgdh 并将质粒转化至 DH5 α,对克隆的基因片段进行测序,将重组质粒再转化至 E.coli BL21

6 .目的基因在大肠杆菌中的表达及纯化:阳性重组菌大量培养后,加异丙基 -B-D 硫代半乳糖苷诱导表达,异丙基 -B-D 硫代半乳糖苷的终浓度为 0.1mmol/L 37 通气培养 5h 4 5000r/min r 16 )离心 15min 收集细菌。将细菌悬浮于 20ml 超声缓冲液( 50mmol/L NaH2PO4 0.5mol/L NaCl pH8.0 )。反复冻融数次,超声破碎菌体, 4 12000r/min r 16 )离心 20min 收集沉淀,加入 7mmol/L 尿素磷酸盐缓冲液, 4 20000r/min r 16 )离心 20min 收集上清液,利用 Ni+-NTA 层析柱进行纯化。

7. 纯化蛋白抗原的 Western blot 检测:诱导表达前后的菌体裂解上清液及纯化产物经 100g /L 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳,按常规方法通过 Bio-Rad 电转印仪,将胶中蛋白转印到聚偏氟乙烯膜上,含 5% 胎牛血清的磷酸盐缓冲液( PBS 4 封闭过夜,次日用 0.1% Tween-PBS 洗涤后,加入 Phgdh 单克隆抗体与膜室温孵育,洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG 1 10000 稀释),电化学发光法显影。

8 .间接酶联免疫吸附法( ELISA )的建立:包被抗原稀释度为 10ng/ml 1 μ g/ml ,血清用 PBS 1 10 1 1000 稀释,方阵试验摸索最佳条件。确定最佳试验条件为,包被重组蛋白 100ng/ml 4 过夜。含有 0.05% 吐温 20 PBS 洗涤 3 次,加入 5% 牛血清白蛋白封闭, 37 孵育 1h 。洗涤后加入 1 400 稀释待测标本 100 μ l 37 孵育 1h ,洗涤 4 次,加入 1 10000 羊抗人 IgG 100 μ l 37% 孵育 45min ,洗涤 5 次,每孔加入四甲基联苯胺 / 过氧化氢底物工作液 100 μ l ,置 37 温箱 10min 。终止反应后置酶标仪 450nm 处读取吸光度( A )值,判定值为阴性对照 A +2 倍标准差。

9 .统计学分析:用 SSPS11.5 统计软件分析,组间率的比较用χ 2 检验。

   

1 Phgdh 的基因扩增:从 HepG2 细胞中提取 RNA 后,经逆转录制备 cDNA 模板进行 PCR 反应,引物扩增片段长度为 1596 140 1735 bp PCR 扩增产物经琼脂凝胶电泳分析,在约 1600bp 附近处有一扩增带,扩增带长度与设计长度相符。

2 TA 阳性克隆测序结果:扩增的目的片段纯化后与 pMD19-T 载体连接,双向测序图谱与基因库核酸数据库中 Phgdh 基因(编号: NM006623.2 )的 140 1735bp 序列完全一致,表明该基因克隆成功。

3 pMD19-T-Phgdh 阳性克隆质粒和 pET-22b(+)-Phgdh 重组阳性克隆质粒的酶切分析: pMD19-T-Phgdh 重组体经 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ酶切后,可见约 1600bp (目的片段 1596bp )和约 2700bp ( pMD19-T 载体 2692bp 大小相符 ) 出现条带; pET-22b(+)-Phgdh 重组质粒经 NdeI XhoI 酶切后,可见约 1600bp (目的片段 1596bp )和约 5500bp[ pET-22b(+) 质粒 5493bp 大小相符 ] 处出现条带,符合研究设计要求。证明重组质粒已插入了目的基因片段。

4 .融合蛋白的表达与纯化:重组表达菌诱导后经十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,在蛋白质相对分子质量约 6.0 × 104 处可见一条诱导表达带,与预期的分子量一致。做不同诱导时间观察,以 5h 诱导表达量略高。表达的目的蛋白占全菌蛋白的 10% 左右,纯化后的蛋白在电泳凝胶上只显示单一蛋白条带(图 1 )。表明获得高度纯化蛋白。

5 融合蛋白的鉴定:通过对表达产物的 Western blot 分析,结果显示, pET-22b(+)-Phgdh 重组质粒诱导后表达了 1 条相对分子质量约 6.0 × 104 的蛋白带,可被鼠抗人 -Phgdh 单克隆抗体识别,表明重组蛋白具有抗原反应性,见图 2

6. ELISA 法检测临床标本:结果显示, AIH PBC CHB CHC 及正常人抗 Phgdh 抗体阳性检出率分别为 66.15% 21.42% 12.50% 6.83% 3.30% AIH Phgdh 自身抗体阳性率显著高于其他各组,与疾病对照组及正常对照组比较,差异均有统计学意义( P<0.01 )。见图 3

   

过去的研究结果显示,在 AIH 中一些主要的自身抗原都是参与活化肝细胞代谢和肝细胞内微粒体代谢的酶(如诊断 AIH- Ⅱ型的抗肝肾微粒体抗体的靶抗原细胞色素 P2D6 )。在本研究的前期工作中,我们应用蛋白质组学策略,进行二维电泳结合免疫印迹试验,对正常人和自身免疫性肝炎患者血清进行差异蛋白筛选,发现在自身免疫性肝炎患者血清中出现相对分子质量约 5.7 × 104 的蛋白点,而在正常人血清中未发现,经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定及生物学信息分析,鉴定该蛋白质为 Phgdh ,相对分子质量约 5.7 × 104 Phgdh 是丝氨酸合成中利用 3- 磷酸甘油酸进行磷酸化途径所必须的酶, 3- 磷酸甘油酸是糖酵解过程中重要的代谢物, Phgdh 在物质代谢中有重要地位 [6-7] ,因此,我们选定 Phgdh 作为自身免疫性肝炎患者的候选自身抗原进一步研究。

为了评价 Phgdh 在自身免疫性肝炎中的临床价值,我们克隆了 Phgdh-cDNA ,将扩增的目的片段与带 His- 标签的 pET-22b(+) 质粒进行 Nde Ⅰ、 Xho Ⅰ双酶切后进行定向克隆,经过酶切鉴定和核酸测序分析证明克隆是成功的。将克隆质粒转入 E.coli.BL(21) 经异丙基 -B-D 硫代半乳糖苷诱导后,在相对分子质量约 5.7 × 104 处出现诱导表达蛋白带,与理论计算值一致。镍柱层析柱对表达蛋白进行纯化得到了单一的纯化蛋白带, Western blot 试验显示表达蛋白带具有抗原反应性。

随后,我们用纯化的表达蛋白包被酶标反应板,摸索 ELISA 反应条件,检测了 AIH 患者组和病毒性肝炎患者组及健康对照组血清,在 AIH 患者血清中抗 -Phgdh 的阳性率明显高于对照组的抗 -Phgdh 检出率。初步研究结果显示,该抗体对 AIH 的诊断有较高的特异性,具有一定的临床意义。由于涉及到抗病毒治疗方案或是免疫抑制治疗方案的采用,临床上自身免疫性肝炎和其他出现自身免疫现象的肝病(包括病毒性肝炎)的鉴别诊断是必要的 [8] 。本研究结果提示,抗 -Phgdh 可能是鉴别 AIH 与病毒性肝炎的血清学标志物之一,这一结果有待于检测更多血清标本进一步证实。

另外,在 AIH 中抗 -Phgdh 阳性率也明显高于 PBC 。少数患者可以出现自身免疫性肝病重叠综合征,其中 AIH/PBC 重叠综合征的发生较为多见 [9-10] 。这一现象给自身免疫性肝病的诊断和治疗策略的制定带来了难度。约 5% 诊断为 AIH 的患者有 PBC 的症状和体征,另外约 19% 诊断为 PBC 的患者也会出现 AIH 的症状。本研究结果显示, PBC 中抗 -Phgdh 自身抗体的检出率明显低于 AIH 中检出率。是否抗 -Phgdh 阳性的 PBC 患者存在 PBC/AIH 重叠综合征尚需进一步观察。

AIH 自身靶抗原的确认一般认为需符合两个条件:( 1 )自身抗原引发的自身免疫反应造成的组织损伤应具备肝特异性;( 2 )该抗原在体内被免疫系统识别(如该抗原在肝细胞表面表达)。迄今,去唾液酸糖蛋白受体是惟一符合上述条件的自身靶抗原 [11-12] 。关于 D-3- 磷酸甘油酸是否可以确定为自身免疫性肝炎的自身靶抗原,还需要深入研究。另外,对于抗 -Phgdh 与抗核抗体等其他自身抗体和免疫学指标的相关性,有待进一步研究。

     

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