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拉米夫定治疗前后乙型肝炎病毒YMDD变异的相关因素分析
http://www.ganbingzixun.com     点击数:2291     更新时间:2010-05-26    【查看评论
曹新鲜 李佳 邱隆敏 罗亚文 陈应华 冉燕

【摘要】   目的   了解遵义地区 HBV 基因型以及拉米夫定治疗前后发生 YMDD 变异的相关因素,及早进行拉米夫定疗效及耐药的预测。 方法   53 例慢性乙型肝炎患者分别在口服拉米夫定前及治疗后 3 6 12 18 24 个月进行血清 HBV DNA 定量、乙型肝炎标志物、 ALT AST 、总胆红素、白蛋白的检测。同时在接受拉米夫定治疗前采用基因测序法检测 HBV 基因型及 YMDD 变异株,治疗后 HBV DNA 定量下降又反弹升高,且血清 HBV DNA 1 × 104 拷贝 /ml 时,再次进行 YMDD 变异株检测。率的比较用卡方检验及确切概率法,两组均数之间比较采用独立样本 t 检验,有序变量之间的比较采用秩和检验。 结果   遵义地区的 HBV 基因型由 B C B+C 基因型构成。拉米夫定治疗后 18 例检出 YMDD 变异株,用药 1 年和 2 年的变异率分别为 15.1% 34.0% HBV 突变类型有 rtL 180M/ M204V rtL 180M/M204I rtM204I rtL 180M 四种,其中 C rtM204V 全部合并 rtL 180M 突变( 100% ), C 基因型中 rtL 180M/ M204V 联合突变及 rtL 180M/M204I 联合突变明显高于 B 基因型( 77.8% 25.0% 22.2% 12.5% ); C 基因型中未见点突变,而 rtM204I rtL 180M 的点突变仅见于 B 基因型。 YMDD 变异与未变异组性别、民族、乙型肝炎家族史及 HBeAg 情况差异无统计学意义( P 0.05 ),病程≥ 2 年组和年龄< 35 岁组变异率明显升高(χ 2 值分别为 4.707 5.853 P 值均< 0.05 )。不同 HBV DNA 滴度患者 YMDD 变异率差异无统计学意义(χ 2 0.801 P 0.05 ),但 HBV DNA<105 拷贝 /ml 者未发现 YMDD 变异。 结论   拉米夫定治疗后 YMDD 变异可能与 HBV 基因型及 P 基因突变类型有关,并随治疗时间的延长而增加。为了减少 YMDD 变异的发生,应选用病程短、 HBV DNA 水平较低、肝损害较重的患者进行拉米夫定治疗,有条件的应检测 HBV 基因型。

【关键词】   肝炎病毒,乙型; 拉米夫定; 基因型; YMDD 变异

 

Identification of factors associated with YMDD mutation in patients with chronic hepatitis B receiving lamivudine treatment    CAO Xin-xian, LI Jia, QIU Long-min, LUO Ya-wen, CHEN Ying-hua, RAN Yan. Department of Infectious Diseases, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, China

Corresponding author: LI Jia, Email: lijia1957@ 126.com

Abstract     Objective        To identify factors associated with YMDD mutation in patients with chronic hepatitis B before and after lamivudine treatment in Zunyi region. Methods     53 patients with chronic hepatitis B were enrolled in this study, HBV DNA,HBV markers, ALT, AST, TBil, albumin in the serum were examined at 0, 3, 6, 12, 18 and 24 months after lamivudine treatment. HBV genotype and YMDD mutation were determined by sequencing before lamivudine treatment. YMDD mutation was checked again if serum HBV DNA rebound to more than 1 × 104 copies/ml after the initial decrease. Results     HBV genotype in Zunyi region is constitute of B, C and B+C genotype. YMDD mutation occurred in 18 cases after lamivudine treatment, the rate of YMDD mutation was 15.1%, and 34.0% after 1 year and 2 years treatment. There are four types of mutation: rtL 180M/M204V, rtL 180M/M204I, rtM204I, rtL 180M. rtM204V mutation in C gene was always acompanied by rtL 180M mutation (100%). The rate of rtL 180M/M204V mutation in genotype C group was significantly higher than that in genotype B group (77.8% to 25.0%), the same was true for the rtL 180M/ M204I mutation (22.2% to 12.5%). There was no point mutation in genotype C group. The point mutation of rtM204I and rtL 180M appeared only in genotype B group. Gender, nation, family history of hepatitis B and HBeAg were not associated with YMDD mutation (P > 0.05), while the mutation rate was associated with the disease course and severity of disease. YMDD mutation did not occure in   patients with low HBV DNA level ( 105 copies/ml). Conclusion     YMDD mutation after lamivudine therapy is associated with HBV genotype and P gene mutation type, and prolonged treatment increases the the mutation rate. In order to reduce the incidence of YMDD mutation, patients with shorter disease course, lower HBV DNA level, more serious liver damage should be treated with lamivudine.

Key words Hepatitis B virus Lamivudine Genotype YMDD variation

拉米夫定通过抑制 HBV 逆转录酶的活性来抑制 HBV 的复制,能显著降低 HBV DNA 载量,促进 ALT 复常和 HBeAg 血清学转换,改善肝脏组织学,但长期使用会引起 YMDD 基序变异,从而导致临床耐药,影响疗效。我们对遵义地区 HBV 基因型以及用拉米夫定治疗前后发生 YMDD 变异的相关因素进行了分析,目的在于及早进行拉米夫定疗效及耐药的预测,为抗病毒治疗提供有针对性的选择,减轻患者经济负担。

资料与方法

1 .病例选择: 2004 2 月- 2007 4 月,本院门诊就诊或住院的 122 例慢性乙型肝炎( CHB )及乙型肝炎肝硬化患者,均符合《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准 [1] 。排除重叠感染甲、丙、丁、戊型肝炎病毒及人类免疫缺陷病毒;排除妊娠、脂肪肝、自身免疫性肝炎等。所有患者接受拉米夫定治疗 12 24 个月。

2 .血清 HBV DNA 及肝功能检测:患者在口服拉米夫定前及治疗后 3 6 12 18 24 个月测定血清 HBV DNA 。仪器为罗氏荧光定量 PCR 仪,试剂由深圳匹基公司提供,严格按说明书进行操作,< 1 × 103 拷贝 /ml 为阴性。酶联免疫吸附法测定乙型肝炎标志物,日本 OLYMPUS AU 2700 全自动生物化学分析仪测定 ALT AST 、总胆红素和白蛋白。

3 HBV 基因型及 YMDD 变异株检测:( 1 )标本采集:患者在接受拉米夫定治疗前空腹采集静脉血 3ml 4h 2000r/min 离心 15min ,吸取血清 -70 保存,用于 检测HBV 基因型及 YMDD 变异株;拉米夫定治疗后 HBV DNA 定量下降又反弹升高,且血清 HBV DNA 1 × 104 拷贝 /ml 时,再次进行 YMDD 变异检测,由浙江大学医学院传染病研究所协助完成。( 2 )引物设计: HBV 基因型及 YMDD 变异株的基因检测采用基因测序的方法完成,根据我国 HBV 基因型特点,从美国生物技术信息中心的基因文库中查找出 HBV 全基因序列,再找出 S 基因和 P 基因的高度保守区,设计出相应引物。 HBV 基因型上、下游引物序列分别为 5 -CTACTGTCTC ASCCATATCG-3 ′和 5 -CCCAATACCACATCA TCC-3 ′。 YMDD 变异 HBV 基因上、下游引物序列分别为 5 -CTCCAATCACTCACCAAC-3 ′和 5 -GGG TTTAAATGTATACCCA-3 ′;由上海生物工程公司合成。( 3 )聚合酶链反应( PCR ): HBV DNA 模板采用常规的碱裂解法提取, PCR 反应体系 X1 X2 1 μ l 25pmol/L ), 10mmol 脱氧三磷酸核苷 1 μ l 25mmol MgCl2 4 μ l 10 ×缓冲液 5 μ l Taq 2.0 2.5U ,加无菌去离子水至 50 μ l ,以上试剂均购自美国 Promaga 公司。 PCR 反应条件: 94 5min 94 45s 55 45s 72 1min 35 个循环; 72 5min 。( 4 PCR 产物纯化:按 Qiaquick PCR 产物纯化试剂盒(购自美国 Qiagen 公司)说明书进行。( 5 ET 末端荧光标记测序: ET 末端标记测序试剂盒购自美国 Amersham Bioscience 公司,按说明书操作,在 MegaBACETM500 测序仪上测序,测序反应结束后,所获 DNA 序列与 DNA start 上的 HBV 全基因序列通过分析软件进行分析,确定其基因型及 YMDD 变异情况。

4. 统计学处理:数据均采用 SPSS15.0 统计软件进行分析,计量资料用均数±标准差表示。率的比较用卡方检验及确切概率法,两组均数之间比较采用独立样本 t 检验,有序变量之间的比较采用秩和检验。

   

1 .一般情况:在治疗过程中,部分患者因经济原因终止治疗,部分患者未能定期随访或采血时治疗未满 1 年,余下 53 例资料齐全的患者,其中男 50 例,女 3 例,年龄( 36.88 ± 9.14 )岁,汉族 49 例,仡佬族 3 例,土家族 1 例。

2 .治疗前后的临床资料:检测结果显示,患者 HBV 基因型由 B C B+C 基因型构成, B 基因型占 56.6% 30/53 ), C 基因型占 41.5% 22/53 ), B+C 基因型 1.9% 1/53 ),未发现 A D E F G H 基因型。拉米夫定治疗前有 1 例患者发生 P 基因突变。拉米夫定治疗后血清 HBV DNA 下降又反弹的患者中, 18 例检出 YMDD 变异株,其中用药 1 年内变异率为 15.1% 8/53 ),用药 2 年变异率 34.0% 18/53 )。

3 YMDD 突变模式与 HBV 基因型的关系:拉米夫定治疗后发生 YMDD 变异的 18 例患者中, B 基因型变异率 26.7% 8/30 ), C 基因型变异率 40.9% 9/22 ),二者差异无统计学意义(χ 2 1.170 P 0.05 ); B+C 基因型 1 例发生变异(表 1 略)。

4 YMDD 变异与临床相关因素分析:拉米夫定治疗后,变异组与未变异组在性别、民族、乙型肝炎家族史及 HBeAg 阳性 / 阴性方面差异无统计学意义( P 值均> 0.05 )。而病程≥ 2 年组与病程< 2 年组的变异率分别为 43.2% 16/37 )和 12.5% 2/16 ),差异有统计学意义(χ 2 4.707 P 0.05 );年龄< 35 岁组与年龄≥ 35 岁组的变异率分别为 50.0% 13/26 )和 18.5% 5/27 ),差异有统计学意义(χ 2 5.853 P 0.05 )。 YMDD 变异检出率, CHB 轻度、中度、重度及乙型肝炎肝硬化组分别为 33.3% 1/3 )、 41.4% 12/29 )、 36.4% 4/11 )和 11.1% 1/9 ),除 CHB 轻度组外,随着病情的加重,检出率呈逐渐下降趋势,但差异无统计学意义( P 0.05 )。

5 YMDD 变异与肝功能的关系:未变异组 ALT AST 、总胆红素水平均比变异组高( P 0.01 ),而两组白蛋白差异无统计学意义( P 0.05 ),见表 2

6 YMDD 变异与 HBV DNA 水平的关系:根据基线 HBV DNA 含量的不同将 53 例患者分为< 106 拷贝 /ml 106 ~< 107 拷贝 /ml 107 ~< 108 拷贝 /ml 、≥ 108 拷贝 /ml 组,结果 YMDD 变异的发生率分别为 25.0% 2/8 )、 28.6% 4/14 )、 37.5% 6/16 )、 40.0% 6/15 ),随着 HBV DNA 含量的增加,变异检出率呈上升趋势,但差异无统计学意义(χ 2 0.801 P 0.05 )。

   

拉米夫定的耐药问题日益受到关注。本研究结果显示,遵义地区的 HBV 基因型主要由 B 型和 C 型构成,与报道相似 [2-3] 53 例患者拉米夫定治疗前经基因测序,发现 1 例存在 P 基因突变,突变位点为 M204I ,该患既往未用过抗病毒药,表明部分患者在接受拉米夫定治疗前体内就已存在 YMDD 变异株。拉米夫定治疗后 18 例检出 YMDD 变异株,用药 1 年和 2 年的 YMDD 变异率分别为 15.1% 34.0% ,与报道接近 [4] 。说明 YMDD 变异的发生随治疗时间的延长而增加。通过对血清 HBV P 基因序列分析,发现本地区突变类型有 rtL 180M/M204V rtL 180M/M204I rtM204I rtL 180M 四种,在 B C 基因型中, C rtM204V 全部合并 rtL 180M 突变,与以往的报道相似 [5] C 基因型的突变率高于 B 基因型, C 基因型中 rtL 180M/M204V 联合突变及 rtL 180M/M204I 联合突变也明显高于 B 基因型, C 基因型中未见点突变,而 rtM204I rtL 180M 的点突变仅见于 B 基因型,提示拉米夫定相关性 HBV 突变以联合变异率较高,而拉米夫定耐药可能与基因型及 P 基因突变类型有关,但还有待扩大样本进一步研究。

长期(一般在 6 个月以上)应用拉米夫定治疗出现的 YMDD 变异可导致患者病情反复 [6] 。本研究结果表明,患者病程越长,用药后的变异率越高; ALT AST 和总胆红素未变异组高于变异组;随着病情的加重,突变的检出率呈逐渐下降趋势;提示肝损害轻的患者可能更易发生 YMDD 变异。我们对基线 HBV DNA 水平与 YMDD 变异发生的分析发现,随着 HBV DNA 含量的增加,变异检出率呈逐渐上升趋势,虽然差异无统计学意义,但这可能与病例数太少有关。而且在我们治疗的病例中, HBV DNA 含量< 105 拷贝 /ml 者,无 YMDD 变异发生。说明拉米夫定治疗时 HBV DNA 高的患者,可能发生 YMDD 变异的风险较大。还有 4 例患者虽有血清病毒学突破,但未检测到 YMDD 变异株,是否存在 HBV 其他位点的突变,值得探讨。

HBV 发生 YMDD 变异的可能相关因素很多,由于本研究是在拉米夫定治疗前及治疗过程中 HBV DNA 定量下降又反弹时进行 YMDD 变异检测,了解变异与临床的关系,故未能观察 YMDD 变异动态变化过程,这还有待研究。

     

[1]Chinese Society of Hepatology and Chinese Society of Infectious Diseases, Chinese Medical Association. The guideline of prevention and treatment for chronic hepatitis B. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 881-891. (in Chinese)

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[4]Chang TT, Lai CL, Chien RN, et al. Four years of lamivudine treatment in Chinese patients with chronic hepatitis B. J Gastroenterol Hepatol, 2004, 19: 1276-1282.

[5]Li MW, Chen Z, Shao JB, et al. Analysis of reverse transcriptase L 180M and reverse transcriptase M204V/I mutation in HBV p gene among the lamivudine resistants. Zhonghua Chuanranbing Zazhi, 2005, 23: 176-177. (in Chinese)

李敏伟 , 陈智 , 邵骏斌 , . 拉米夫定耐药者 HBV P 基因 rtL 180M rtM204V/I 突变分析 . 中华传染病杂志 ,2005,23:176-177.  

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