【摘要】目的
探讨阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎耐药性产生的原因。
方法
从阿德福韦酯Ⅲ期临床试验中筛选出
30
例原发治疗失败或继发耐药患者,应用巢式逆转录聚合酶链反应扩增
HBV RT
区,比对
RT
区核苷酸及氨基酸序列,找出变异位点。
结果
30
株阿德福韦酯治疗失败者中有
21
株
HBV
表现出原发性耐药
,
其中
5
株具有多态性位点
rtN118H (23.8%, 5/21)
。另外
9
株发生继发性耐药,继发耐药毒株在
RT
保守区(
C
结构域
rtM207V
)和非保守区多个区域均有变异。没有发现典型的
rtN236T
和
rtA181V/T
突变。
结论
多态性位点
rtN118H
与阿德福韦酯原发耐药可能有关。
HBV RT C
结构域
rtM207V
变异及其他处于非保守区的变异可能与
HBV
继发性耐药有关,天然耐药准种的存在可能是
HBV
对阿德福韦酯迅速耐药
(
继发性
)
的基础。上述结论有待进一步表型验证实验加以证实。
【关键词】肝炎,乙型,慢性;
阿德福韦酯;
耐药;
准种
Dissection of mechanism for the adefovir dipivoxil resistance in chronic hepatitis B patients
ZENG Ai-zhong, LU Ping, DENG Hui, CAI Su-fang, YANG Chun, XIN Xiao-juan, GUO Jin-jun, LI Qing-ling, DENG Xiao-yan, HUANG Ai-long. Department of Infectious Disease, The First Affiliated Hospital of
Chongqing
Medical
University,
Chongqing 400016,
China
Email: aizhong9@yahoo.com.cn
【
Abstract
】
Objective
To explore the mechanism for adefovir dipivoxil (ADV) resistance occurred in chronic hepatitis B patients of a series of phase III clinical trails. Methods
30 resistant HBV strains were selected out from 177 cases of ADV treated chronic hepatitis B patients. HBV polymerase RT region were amplified by nested PCR and analyzed with the standard neucleiotide sequence of HBV strains deposited in GeneBank. Results
21 out of 30 HBV strains were primary resistant strains, among them 5 HBV strains (23.8%, 5/21) had the polymorphism site of rtN118H. While the other 9 HBV strains showed secondary resistance, variations in conservative region C (rtM207V) and other non-conservative regions were found. The classic mutation sites such as rtN236T and rtA181V/T were not found. Conclusions
Polymorphism site of rtN118H might be responsible for HBV primary resistance to ADV therapy. rtM207V variation in HBV RT C domain and other variation sites might play a role in HBV secondary resistance to ADV treatment, and natural resistant quasispecies may be the basis for the ADV quick resistance. These conclusions await further confirmation by phenotype test.
【
Key words
】
Hepatitis B, chronic;
Adefovir dipivoxil;
Resistance;
Quasispecies
核苷类似物抑制
HBV
复制疗效确切可靠,能够逆转早期肝纤维化,阻止或降低肝硬化或
HCC
发生的风险。核苷类似物长期抗
HBV
治疗所面临的最重要问题之一是
HBV
出现的耐药性
[1]
。尽管一系列其他因素,包括个体代谢差异、药物不良反应、临床用药方式不当、患者依从性差等因素影响慢性乙型肝炎的治疗效果,但
HBV
耐药仍然成为治疗失败的最重要因素
[2]
。
我们在对阿德福韦酯(
adefovir dipivoxil
,
ADV
)Ⅲ期临床试验
177
例慢性乙型肝炎患者资料分析后筛选出
30
例原发治疗失败或继发耐药患者,通过分析耐药
HBV
毒株
RT
区核苷酸及氨基酸序列,并与阿德福韦治疗前的野毒株序列进行比对,初步揭示
ADV
治疗前后
HBV RT
保守区和非保守区变异与
ADV
耐药的关系。
资料与方法
一、资料
1
.研究对象:
2005
年
9
月
-2007
年
8
月在重庆医科大学附属第一医院感染科门诊和住院部应用
ADV
(每天口服
1
次、每次
10mg
、疗程
1
年)治疗的
177
例慢性乙型肝炎患者,其中男
142
例,女
35
例,平均年龄(
33.6
±
8.5
)岁。筛选标准、用药方案及检测指标参见文献
[3]
,血清标本于
-80
℃
存放。
2
.主要试剂及仪器参见文献
[4]
。
二、方法
1
.血清标本
HBV DNA
提取:采用罗氏公司
High pure viral nucleic kit
试剂盒
,
操作按说明书进行。提取的
HBV DNA
溶于
50
μ
l
洗脱缓冲液中
-80
℃
保存备用。
2
.
HBV DNA
滴度测定和基因型检测参见文献
[3]
。根据
Locarnini
原发性耐药及继发性耐药的定义筛选出原发耐药和继发耐药毒株
[5]
。
3
.
ADV
治疗前后耐药
HBV RT
区巢式逆转录聚合酶链反应(巢式
PCR
)扩增、测序:根据
HBV
标准株
[
编号
D00330 Ba
亚型(
adw
),编号
AB073858 Bj
亚型和编号
AB
033556 C
型(
adw
)
] B
、
C
基因型
RT
区保守序列,自行设计二对引物。外引物:正向为
hbvRTP1
(
nt13
~
39
)
5
′
-CCACC AAACTCTTCAAGATCCCGGAGT-3
′,反向为
hbvRTP4
(
nt1199
~
1181
)
5
′
-GTTGGGTCAGC AAACACTTGGCA-3
′;内引物
:
正向为
hbvRTP2
(
nt62
~
90
)
5
′
-GGTGGCTCCAGTTCMGGAAC AGTGM(G/A)CCC-3
′,反向为
hbvRTP3(nt1061
~
1036) 5
′
-GGCATTAAAGCAGGATA TCCACATTG-3
′。
PCR
的反应体系:
5
×
PS
缓冲液(含
Mg2+
)
5
μ
l
、
dNTPs (2.5mmol/L) 2
μ
l
、引物(
10
μ
mol/L
)各
1
μ
l
、
PrimeStarDNA
聚合酶
0.25
μ
l
、
HBV DNA
模板
2
μ
l
、灭菌双蒸水
14
μ
l
。反应条件:
94
℃
5min
;
94
℃
30s
,
55
℃
15s
,
72
℃
80s,
共
35
个循环。第
2
轮
PCR
反应以第
1
轮
PCR
产物
1
μ
l
作为模板、反应体系和反应条件与第
1
轮
PCR
相同。通常先用外引物行第
1
轮
PCR
扩增
,
如无阳性条带
,
则再用内引物行第
2
轮巢式
PCR
扩增。引物由上海生工生物工程有限公司合成。取
PCR
产物
3
μ
l
进行琼脂糖凝胶电泳,对扩增产物进行初步鉴定。
PCR
产物纯化后,经
ABI PRISM 3100
基因测序仪分析和
Sequence analysis
5.1.1
软件读取测序结果,利用
http://workbench.sdsc.edu
网站对
ADV
耐药患者
HBV RT
区核苷酸和氨基酸序列、
ADV
治疗前患者
HBV RT
区序列及
GenBank
中
3
条标准序列进行比对,寻找
HBV RT
区内核苷酸变异。
结
果
一、
30
例原发治疗失败或继发耐药患者
HBV DNA
滴度测定及基因型分析
治疗
3
个月内,
HBV DNA
滴度下降≤
1log10IU/ml
的有
21
株即为原发耐药株
(
也包括抗病毒治疗过程中
HBV DNA
值始终未下降到
4log10IU/ml
以下者
)
。经过间隔
1
个月的连续
2
次检测证实,在治疗有效(
HBV DNA
值下降≥
1log10IU/ml
)的情况下出现病毒复制指标反弹,
HBV DNA
上升≥
1log10IU/ml
的有
9
株即为继发耐药株。总共
30
株
HBV
耐药毒株中
B
基因型占
24
株
, C
基因型
6
株。其中
21
例原发治疗失败患者感染
B
基因型
HBV 18
株
, C
基因型
3
株,另
9
例继发性耐药中
B
基因型
6
株
, C
基因型
3
株。
二、
2
例典型
ADV
继发耐药毒株病毒学突破、临床生物化学突破与治疗时间的关系
9
例继发耐药患者中,
2
例较为典型,我们对继发耐药毒株感染患者病毒学突破、生物化学突破及其与治疗时间的关系进行了分析。其余
7
例,变化类似。
1.
样本号
21
患者血清
HBV DNA
、
ALT
与治疗时间的关系:该患者治疗前
HBV DNA
为(
2.76E+07
)拷贝
/ml
,
ALT 96U/L
;治疗
12
周时
HBV DNA
降至(
6.86E+03
)拷贝
/ml
,
ALT
降为
33U/L
;治疗
24
周时,
HBV DNA
反弹,上升为(
7.78E+05
)拷贝
/ml
,此时
ALT
为
30U/L,
至
36
周时
HBV DNA
为(
3.24E+05
)拷贝
/ml
,
ALT
反弹上升至
116U/L
;继续治疗至
48
周时
HBV DNA
为(
1.53E+05
)拷贝
/ml
,
ALT
为
127U/L (
图
1)
。
2.
样本号
52
的患者血清
HBV DNA
、
ALT
与治疗时间的关系:该患者治疗前
HBV DNA
为(
1.30E+08
)拷贝
/ml
,
ALT 95U/L
;治疗
8
周时
HBV DNA
降至(
9.70E+05
)拷贝
/ml
,
ALT
降至
55U/L
;
12
周时
HBV DNA
为(
1.20E+06
)拷贝
/ml
,
ALT
为
49U/L
;治疗
24
周时
HBV DNA
反弹上升至(
2.50E+07
)拷贝
/ml
,
ALT
为
43U/L
;到
48
周时
HBV DNA
为(
6.10E+06
)拷贝
/ml
,此时
ALT
反弹升至
142U/L (
图
2)
。
三、
ADV
治疗前后耐药毒株
RT
区巢式
PCR
扩增及变异位点分析
1.
部分原发或继发耐药标本
ADV
治疗前后
RT
区
PCR
扩增:对
10
株耐药毒株感染者治疗前(
0
周)及治疗后(
48
周)临床标本
HBV DNA RT
区
PCR
扩增,扩增产物约为
1100bp
(图
3
)。
2.
部分原发或继发耐药毒株
RT
区变异位点分析:(
1
)
HBV RT
区多态性位点筛选:共有
6
株
HBV
治疗前、治疗
24
周及
48
周时第
481
位核苷酸
(nt 481)
均为
c
(
Ba
、
Bj
亚型为
a
)
,
与标准株比较,该位点出现
rtN118H
(
aat
→
cat
)变异。提示
rt118H
为多态性位点。其中
5
株表现出原发性耐药。具有多态性位点
rtN118H
的耐药毒株占原发性耐药株的
23.8%
(
5/21
)。其他多态性位点有
rtM
271L
(
nt940 atg
→
gtg, 14.3%, 3/21
)和
rtY
141F
(
14.3%, 3/21
)。(
2
)
HBV RT
区变异位点筛选:样本号
21
、
52
、
75
和
80
等具有典型继发性耐药的特点,在发生
HBV DNA
反弹前己出现了某些位点核苷酸的变异。以
21
号标本为例,在治疗前核苷酸第
1042
位
(
测序图中为
nt821
位
)
主要为碱基
T,
有极少碱基
C
(
<T
碱基数的
5%
);第
12
周时(
nt773
位)
,
碱基
C
大幅上升(为
T
碱基数的
50%
);第
24
周(
nt764
位)
,
碱基
C
含量超过碱基
T
含量
,
出现
rtY305H
变异;
第
48
周时(
nt778
位)碱基
C
仍略占优势(图
4
)。
讨
论
Locarnini
等
[5]
国际专家组对核苷类似物治疗失败的定义作了规范:在排除患者依从性、代谢性、和胃肠吸收等因素外,原发性耐药是指治疗
3
个月内,
HBV DNA
检测值下降≤
1log10IU/ml
。继发性耐药是指经过间隔
1
个月的连续
2
次检测证实,在治疗有效(
HBV DNA
下降≥
1log10IU/ml
)的情况下出现病毒复制指标反弹,
HBV DNA
上升≥
1log10IU/ml
。侯金林和孙剑
[6]
补充认为原发性耐药也应包括抗病毒治疗过程中
HBV DNA
从未下降到
4log10IU/ml
以下者。
根据该定义,我们从
177
例
ADV
治疗的慢性乙型肝炎患者中筛选出
30
株
ADV
耐药株
HBV
,其中
21
株(
11.9%
)为原发性耐药、
9
(
5.1%
)株为继发性耐药。耐药率明显高于国外临床研究资料。但最近也有关于
ADV
治疗失败率高达
31.5%
(
2
年)的报道
[2]
。本研究结果显示,继发性耐药患者在治疗过程中出现了血清
HBV DNA
和
ALT
反弹,
HBV DNA
常常反弹在先,
1
~
3
个月之后
ALT
开始上升。这些现象表明肝脏病变的活动与
HBV
复制密切相关,可能与大量病毒抗原释放激活免疫反应致肝细胞损害有关。
Schildgen
等
[7]
发现多态性位点(
rtI233V
)与
3
例
ADV
原发性耐药有关。体外实验证实含
rtI233V
的变异株与野生型毒株相比,
ADV
的
50%
抑制浓度增加了
6
~
12
倍。本研究结果显示在
21
例阿德福韦原发耐药患者中有
5
例(
23.8%
)患者具有新的多态性位点
rtN118H
。这些患者对
ADV
治疗缺乏反应,临床病毒学及生物化学指标没有任何改善,提示多态性位点
rtN118H
与
ADV
原发耐药可能有关。多态性位点
rtM
271L
和
rtY
141F
各占
14.3%
。这些多态性位点尤其是
rtN118H
位点是否确与
ADV
的天然(原发)无反应性有关,值得进一步研究。
本研究中有
1
例患者在治疗初始时
nt1024
位即存在
T
和
C
两种核苷酸
,
治疗过程中核苷酸
C
逐渐上升,
HBV DNA
开始反弹,
24
周时则超过核苷酸
T
,出现
rtY305H
变异,变异株成为优势株,
HBV DNA
也达到峰值,此时血清
ALT
开始升高;由此推测该例患者至少存在两个以上准种感染,其中一个含
nt1024
为
C
的准种经
ADV
筛选后从劣势株迅速成长为优势株
(12
~
24
周
)
,导致对
ADV
耐药。与此类似,
1
例患者在治疗
48
周时出现
rtA222T
和
rtH126Y
变异;
1
例患者在治疗
36
周时出现
rtM207V
变异。因此,我们推测天然耐药准种的存在是对
ADV
迅速耐药的基础。这种推论仍然需要对
rtY305H
等变异进行表型确证实验。
我们发现耐药
HBV RT
区多个区域均有变异
:
如聚合酶
C
保守区
rtM207V
变异及其他非保守区的变异(如
rtY305H
、
rtK149Q
等),这些变异均有可能通过改变聚合酶的空间构像或通过影响调控序列而增强变异株的复制力,从而表现出致病性的增强和耐药性的产生
[8]
。张继明等
[8]
对
72
例拉米夫定临床耐药患者进行
RT
区分析
,
发现其中
12
例耐药患者
HBV
并无典型
YMDD
变异
,
但在非保守区发现其他变异位点,他们认为拉米夫定耐药与这些非保守区变异位点有关。
我们在全部
ADV
耐药株中均没有发现典型的
rtN236T
和
rtA181V/T
突变,究其原因可能是:治疗时间偏短,只有
48
周。目前文献报道
rtN236T
和
rtA181V/T
出现的最快时间为
52
周,因为
rtN236T
和
rtA181V/T
是完全新出现的突变,需要较长的筛选时间,而不是象我们研究中预先存在的准种那样,能被
ADV
较快的筛选出来(
12
~
24
周)。这些差异可能与国内外
HBV
基因型构成不同有关,国外主要是
A
、
D
型,国内以
B
、
C
型为主。
B
、
C
型对干扰素、核苷类药物的疗效要差于
A
、
D
型。也可能与国内存在乙型肝炎不规范治疗导致准种产生过多有关。
HBV
的致病性和耐药性除了与其自身特点有密切关系外,还与宿主因素密不可分,与药物本身的特性也有重要关系。
最近发现了几个宿主介导的对核苷(酸)类似物耐药的机制
[9]
。碱基及核苷(酸)类似物通过两个不同家族外排泵外排增加:
P
糖蛋白
-
(
Pgp
)和耐多药蛋白(
MRP 1-9
)。过度表达两种透膜蛋白
MRP4
或
MRP5
时,肝细胞对核苷类似物细胞毒作用的耐受性增加。体外试验也观察到
MRP4
或
MRP5
能够将阿德福韦和替诺福韦泵出到胞外。
Chou
等
[10]
证实在体外人细胞系表达一种新近鉴定的广泛存在于细胞质中的核酸酶(
cN-1
)时,该细胞系对双脱氧胞苷及其衍生物的细胞毒作用的耐受性提高了
300
倍。
总之,
HBV
对核苷(酸)类似物的耐药是病毒、宿主和药物等多种因素相互作用的结果。本项研究提示多态性位点尤其是
rtN118H
与
ADV
的天然无反应性(原发耐药)可能有关,而治疗后
HBV DNA RT
变异
(
准种筛选
)
可能是导致
ADV
快速耐药的重要因素(继发耐药)。宿主因素在耐药性产生中起什么作用,也有待进一步深入研究。
参
考
文
献
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(
收稿日期:
2009-01-09
) |